聚乙烯亞胺PEI-Pro（GMP）是一種GMP級(jí)別的轉(zhuǎn)染試劑，其操作與維護(hù)指南主要包括以下內(nèi)容：

　　一、操作指南

　　1.貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作

　　以6孔板轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞為例：

　　轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備：

　　轉(zhuǎn)染前一天：用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（不建議用胰酶）。按照每孔2×10^6的細(xì)胞量接種293T至6孔板（每孔加入2ml新鮮的DMEM:F12+5%FBS培養(yǎng)基和1ml的細(xì)胞懸液），置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。

　　24小時(shí)后，移除之前培養(yǎng)基，每孔加入2ml新鮮的DMEM:F12+5%FBS。注意確保293T細(xì)胞生長狀態(tài)良好，傳代不超過15代。

　　第一天：顯微鏡下檢查細(xì)胞匯合度，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%到80%的匯合度時(shí)，開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

　　轉(zhuǎn)染步驟：

　　對(duì)于每孔細(xì)胞，用100μl無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋DNA，使DNA終濃度為1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）。

　　對(duì)于每孔細(xì)胞，用100μl無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋適當(dāng)比例的適量BIOHUB-PRO GMP。DNA與BIOHUB-PRO GMP的比例要根據(jù)實(shí)驗(yàn)摸索最適比例。

　　將稀釋的BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中（總體積200μL），輕輕混勻，室溫孵育30分鐘。

　　小心地將BIOHUB-PRO GMP復(fù)合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。注意加入混合液時(shí)輕輕沿著孔板邊緣滴入，避免破壞細(xì)胞的粘附性。

　　將培養(yǎng)板放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

　　觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果：

　　第二天：在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，通常超過80%的293T細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)可以觀察到綠色熒光。

　　2.懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作

　　以293F細(xì)胞于100mL培養(yǎng)瓶（溶液體積占瓶體積的1/5）操作體系為例：

　　細(xì)胞培養(yǎng)：

　　HEK293F細(xì)胞傳代接種于20mL懸浮細(xì)胞生長培養(yǎng)基中，在36.5℃、120rpm、5%CO2的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10^6cells/mL時(shí)，旋緊瓶口放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)，2~4小時(shí)后可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

　　轉(zhuǎn)染步驟：

　　用1mlOptiPRO?SFM（無血清培養(yǎng)基）稀釋適量的DNA，使DNA終濃度為1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）?；靹虿㈧o置5分鐘。

　　用1mlOptiPRO?SFM（無血清培養(yǎng)基）稀釋適當(dāng)比例的BIOHUB-PRO GMP，混勻并靜置10分鐘。

　　將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中，輕輕混勻，室溫孵育30分鐘。

　　將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，搖勻后旋緊瓶口放回?fù)u床（36.5℃、5%CO2、120rpm）。

　　基因表達(dá)檢測：

　　基因表達(dá)可在24~72小時(shí)后檢測，具體時(shí)間取決于細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因。
 

　　二、維護(hù)指南

　　1.儲(chǔ)存條件

　　PEI-Pro（GMP）轉(zhuǎn)染試劑建議儲(chǔ)存在低溫環(huán)境中，如4℃冰箱或-20℃冰凍條件下。低溫環(huán)境能夠有效延緩PEI分子結(jié)構(gòu)的降解，保持其穩(wěn)定性。

　　避免PEI溶液的反復(fù)凍融，以保持其最佳狀態(tài)。

　　2.使用注意事項(xiàng)

　　PEI-Pro（GMP）轉(zhuǎn)染試劑的使用濃度是實(shí)驗(yàn)效果的關(guān)鍵因素之一。一般建議將PEI溶液稀釋至適合的工作濃度后立即使用，避免長時(shí)間儲(chǔ)存稀釋后的溶液。

　　不同的細(xì)胞類型對(duì)PEI濃度的敏感度不同，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)具體細(xì)胞的需求進(jìn)行優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)染效率。

　　若發(fā)現(xiàn)PEI溶液出現(xiàn)沉淀、渾濁或顏色變化，可能意味著其已發(fā)生降解，建議此時(shí)更換新的試劑，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　3.定期驗(yàn)證

　　長期保存的PEI-Pro（GMP）轉(zhuǎn)染試劑在使用前應(yīng)進(jìn)行小規(guī)模實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率是否依然符合要求，這樣可以避免浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)材料和時(shí)間。

　　4.更新與替換

　　對(duì)于經(jīng)常需要使用PEI-Pro（GMP）轉(zhuǎn)染試劑的實(shí)驗(yàn)室，建議定期更新儲(chǔ)存的試劑，并按照生產(chǎn)商的建議進(jìn)行正確的儲(chǔ)存和使用。

　　通過以上操作與維護(hù)指南，可以確保聚乙烯亞胺PEI-Pro（GMP）轉(zhuǎn)染試劑在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的有效性和穩(wěn)定性，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。